貓頭鷹喜歡吃鼠類， 比如黑線姬鼠、黑線倉鼠、大倉鼠、棕色田鼠等農田鼠類和小家鼠、褐家鼠等居民區鼠類。貓頭鷹也吃雀類、鶯類、蝙蝠、甲蟲、金龜子、蝗蟲、螻蛄等小型鳥類、哺乳類和昆蟲。貓頭鷹是捕鼠能力最強的鳥類，一隻貓頭鷹每年可以吃掉1000多隻老鼠。
貓頭鷹有吐“食丸”的習性，其素囔具有消化能力，食物常常整吞下去，並將食物中不能消化的骨骼、羽毛、毛髮、幾丁質等殘物渣滓整合小團，經過食道和口腔吐出，叫食丸，也叫唾餘。
貓頭鷹喜歡白天躲在樹葉間睡覺，等到夜幕降臨出覓食，是森林裡的捕鼠專家。由於貓頭鷹的眼睛長在頭部前方，不像別的鳥那樣長在兩邊，因此它們想全方位觀察四周情況時，只能不停地轉動腦袋。
貓頭鷹一旦判斷出獵物的方位，便迅速出擊。貓頭鷹的羽毛非常柔軟，翅膀羽毛上有天鵝絨般密生的羽絨，因而貓頭鷹飛行時產生的聲波頻率小於1千赫，而一般哺乳動物耳朵是感覺不到那麼低的頻率的。這樣無聲的出擊使貓頭鷹的進攻更有“閃電戰”的效果。
據研究，貓頭鷹在撲擊獵物時，它的聽覺仍起定位作用。它能根據獵物移動時產生的響動，不斷調整撲擊方向，最後出爪，一舉奏效。
